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考马斯亮蓝法

发布时间:2018-12-05 00:02 来源:未知 编辑:admin

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  考马斯亮蓝法

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  也称考马斯蓝染色法(coomassie blue staining)又称Bradford法,是 Bradford 于 1976 年成立起来的一种卵白质浓度的测定方式。

  因为其凸起的长处,正获得越来越普遍的使用。

  考马斯蓝亮法

  coomassie blue staining

  考马斯亮蓝法

  考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定卵白质含量属于染料连系法的一种。在游离形态下呈红色,最大光接收在488nm;当它与卵白质连系后变为青色,卵白质-色素连系物在595nm波长下有最大光接收。其光接收值与卵白质含量成反比,因而可用于卵白质的定量测定。卵白质与考马斯亮蓝G-250连系在2min摆布的时间内达到均衡,完成反映十分敏捷;其连系物在室温下1h内连结不变。该法是1976年Bradford成立,试剂配制简单,操作简洁快速,反映很是活络,活络度比Lowry法还高4倍,可测定微克级卵白质含量,测定卵白质浓度范畴为0~1 000μg/mL,最小可测2.5μg/mL卵白质,是一种常用的微量卵白质快速测定方式。

  考马斯亮蓝有G250和R250两种。此中考马斯亮蓝G250因为与卵白质的连系反映十分敏捷,常用来作为卵白质含量的测定。考马斯亮蓝R250与卵白质反映虽然比力迟缓,可是能够被洗脱下去,所以能够用来对电泳条带染色。

  考马斯亮蓝法测定卵白质含量流程:

  该方式用于大大都卵白质的定量是比力切确的,但不合用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶溶菌酶。去污剂的浓度跨越0.2%影响测定成果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。

  1.Bradford浓染液的配制:将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇,插手100ml85%的磷酸,然后,用蒸馏水弥补至200ml,此染液放4℃至多6个月连结不变。

  2.尺度曲线卵白质样本的预备:尽量利用与待测样赋性质附近的卵白质作为尺度品,例如测定抗体,可用纯化的抗体作为尺度。若是待测样本是未知的,也可用抗体作为尺度卵白。凡是在20ug—150ug/100ul之间绘制尺度曲线.将待测样本溶于缓冲溶液中,该缓冲溶液应与制造尺度曲线的缓冲溶液不异(最好用PBS)。

  4.按1:4用蒸馏水稀释浓染料连系溶液,如呈现沉淀,过滤除去。

  5.每个样本加5ml稀释的染料连系溶液,感化5~30min。染液与卵白质连系后,将由红色变为蓝色,在595nm波长下测定其吸光度。留意,显色反映不得跨越30min.

  6.按照尺度曲线计较待测样本的浓度。

  考马斯亮蓝和皮肤中卵白质通过范德华力连系,反映快速,而且不变,无法用通俗试剂洗掉。待一两周摆布,皮屑细胞天然衰老零落即可无碍。

  考马斯亮蓝法

  考马斯亮蓝显色法的根基道理是按照卵白质可与考马斯亮蓝G-250 定量连系。当考马斯亮蓝 G-250 与卵白质连系后,其对可见光的最大接收峰从 465nm 变为 595nm。在考马斯亮蓝 G-250

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